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第一章 绪论 1

第一节 食品生物技术概述 1

一、食品生物技术的定义 1

二、食品生物技术在食品工业中的重要地位与作用 2

三、食品生物技术的研究进展 4

第二节 食品生物技术的应用领域与发展趋势 8

一、拓展可食用资源 8

二、改进食品加工工艺 9

三、改善食品性能提高食品质量 10

四、开发功能食品及新型食品 11

五、提高农副产品的加工深度 11

六、增加食品包装功能 11

七、保证食品营养与安全 14

八、在食品贮藏保鲜中的应用 16

九、食品生物技术的发展趋势 18

参考文献 19

第二章 食品微生物制造 21

第一节 概述 21

一、微生物制造及其市场分析 21

二、食品微生物制造及在食品工业中的重要地位 22

第二节 食品微生物制造的类型 22

一、微生物制造传统生物食品 22

二、微生物制造食品用酶制剂 23

三、微生物制造有机酸 24

四、微生物制造增稠剂 25

五、微生物制造生物防腐剂 27

六、微生物制造维生素 29

七、微生物制造油脂 31

八、微生物制造食品添加剂 31

九、微生物制造色素 31

十、微生物制造香精香料 32

第三节 食品微生物制造中的关键科学问题 32

一、后基因组时代的食品微生物制造的特点 32

二、食品制造微生物生理功能的影响因素 34

第四节 食品微生物的功能调控与优化研究现状 36

一、微生物必需基因的鉴定 36

二、基于系统生物学和代谢工程的微生物细胞功能改造策略 36

三、辅因子工程技术提高微生物代谢效率 39

四、提高食品制造微生物对非生宜环境适应能力的代谢工程策略 41

参考文献 46

第三章 重要食品制造微生物代谢工程与生理功能 49

第一节 重要食品微生物基因组测序与特性分析 49

一、食品微生物基因组学 49

二、典型食品微生物基因组学研究进展 51

三、食品微生物基因组学的应用 59

第二节 乳酸菌代谢工程与生理功能改造策略 61

一、基于基因工程和代谢工程的乳酸菌分子改造 62

二、基于病理生物技术的乳酸菌改造策略 64

三、基于生理功能的乳酸菌改造策略 65

第三节 霉菌代谢工程与生理功能改造策略 68

一、霉菌及其应用 68

二、霉菌的基因操作平台 68

三、霉菌生理功能改造策略 72

第四节 酵母代谢工程与生理功能改造策略 74

一、酵母基因工程原理 74

二、改良酵母细胞生理特性 77

第五节 杆菌代谢工程与生理功能改造策略 79

一、杆菌及其在食品工业中的应用 79

二、杆菌的代谢工程和生理改造策略 80

参考文献 85

第四章 利用代谢工程手段改善乳酸乳球菌胁迫抗性的研究 89

第一节 代谢工程策略改善乳酸菌胁迫研究概述 89

一、乳酸乳球菌在代谢工程中的重要作用 89

二、乳酸乳球菌面临的胁迫 90

三、提高乳酸乳球菌抵御胁迫的策略 91

第二节 在乳酸乳球菌NZ9000中生产外源谷氨酰胺转氨酶显著改善宿主菌好氧生长性能 95

一、mtg基因在乳酸乳球菌NZ9000中的活性表达 96

二、巯基乙醇对乳酸乳球菌NZ9000（pFL010）和乳酸乳球菌NZ9000（pNZ8148）好氧生长的影响 97

三、mtg基因在乳酸乳球菌胞内活性表达促进了细胞好氧生长 97

四、pH对乳酸脱氢酶和NADH氧化酶活性的影响 101

五、乳酸乳球菌在不同培养条件下生物量的比较 101

六、关于mtg基因在乳酸乳球菌中的表达的三个问题 102

第三节 在乳酸乳球菌NZ9000中生产外源谷氨酰胺转氨酶对宿主菌胁迫抗性的影响 104

一、乳酸乳球菌NZ9000（pFL010）和乳酸乳球菌NZ9000（pNZ8148）氧胁迫抗性的比较 105

二、MTG的分离纯化 107

三、MTG纯酶清除氧自由基活性的测定 107

第四节 谷胱甘肽保护乳酸乳球菌NZ9000抵抗氧胁迫 109

一、半胱氨酸对乳酸乳球菌好氧生长的影响 110

二、GSH对乳酸乳球菌NZ9000抵抗H2O2氧胁迫抗性的影响 110

三、GSH对乳酸乳球菌NZ9000抵抗甲萘醌引发的氧胁迫抗性的影响 112

四、GSH对乳酸乳球菌NZ9000的SodA缺失的互补作用 114

五、GSH保护乳酸乳球菌的生理机制 116

第五节 谷胱甘肽保护乳酸乳球菌SK11抵抗氧胁迫和酸胁迫 118

一、GSH在乳酸乳球菌SK11中的生产 118

二、GSH对乳酸乳球菌SK11生长的影响 120

三、GSH对乳酸乳球菌SK11氧胁迫抗性的影响 121

四、乳酸乳球菌SK11（pNZ9530/pNZ3203）和乳酸乳球菌SK11（pNZ9530/pNZ8148）发酵液中NH4＋浓度的比较 122

第六节 一株具有谷胱甘肽合成能力的乳酸乳球菌的分离与初步研究 122

一、乳酸乳球菌选择性培养基的确定 123

二、产GSH的乳酸乳球菌的初筛 123

三、引物的设计及产GSH的乳酸乳球菌的复筛 123

四、菌株3C的系统发育树分析与形态鉴定 124

五、乳酸乳球菌CCSYU10100的好氧生长 125

六、乳酸乳球菌CCSYU10100产GSH能力的鉴定 125

七、乳酸乳球菌CCSYU10100部分gshB基因的分析 125

参考文献 127

第五章 谷胱甘肽对乳酸菌胁迫抗性的调控机制研究 130

第一节 谷胱甘肽对乳酸菌胁迫抗性的调控机制研究 130

一、乳酸菌及其在食品工业中的应用 130

二、乳酸菌在食品微生物制造过程中遭遇的冷冻胁迫 132

三、谷胱甘肽改善乳酸菌的生理性能 133

第二节 外源添加谷胱甘肽显著提高旧金山乳杆菌DSM20451T冷冻胁迫抗性 134

一、在化学合成培养基（CDM）中旧金山乳杆菌对GSH的吸收 135

二、添加时间和添加浓度对MRS培养基中旧金山乳杆菌胞内GSH浓度积累的影响 135

三、经历不同前培养时期的菌体冷冻抗性比较 136

四、GSH对冷冻胁迫后细胞生长速率的影响 137

五、细胞内外GSH在抗冷冻胁迫中的作用比较 138

六、GSH与谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸混合物对细胞冷冻抗性的作用比较 139

第三节 谷胱甘肽对冷冻胁迫前后旧金山乳杆菌DSM20451T代谢活性的调控 140

一、冷冻胁迫前GSH添加对旧金山乳杆菌DSM20451T代谢的影响 141

二、冷冻胁迫条件下GSH对旧金山乳杆菌DSM20451T代谢的影响 142

三、重培养过程中代谢关键酶活性的变化 144

四、冷冻胁迫和重培养过程中胞内GSH浓度的变化 144

五、冷冻胁迫下胞内pH的变化 145

第四节 谷胱甘肽对冷冻胁迫中细胞膜损伤的抵御机制 147

一、GSH对冷冻胁迫过程中旧金山乳杆菌DSM20451T细胞膜结构的影响 147

二、GSH对冷冻胁迫过程中旧金山乳杆菌DSM20451T细胞膜脂肪酸成分的影响 147

三、冷冻胁迫中GSH对细胞膜中亚油酸含量的影响 150

四、冷冻胁迫条件下旧金山乳杆菌DSM20451T胞内氧化还原状态的变化 151

五、冷冻胁迫中GSH对Na+,K+-ATPase的保护作用 153

第五节 蛋白质组水平上谷胱甘肽对旧金山乳杆菌DSM20451T冷冻胁迫抗性的影响 155

一、冷冻胁迫前旧金山乳杆菌DSM20451T（GSH+）与DSM20451T（GSH-）的蛋白质组学分析 156

二、冷冻胁迫后旧金山乳杆菌DSM20451T（GSH+）与DSM20451T（GSH-）的蛋白质组学分析 157

三、二维电泳图谱的蛋白质差异点分析 158

第六节 谷胱甘肽对乳酸菌酸胁迫抗性的影响 161

一、GSH对乳酸菌抗酸胁迫能力的影响 162

二、酸胁迫过程中胞内pH（pHi）的变化 164

三、GSH在酸胁迫过程中的浓度变化 166

四、GSH对酸胁迫过程中3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）的调控 166

参考文献 168

第六章 吸水链霉菌谷氨酰胺转氨酶的活化机制和生理功能 170

第一节 吸水链霉菌发酵生产谷氨酰胺转氨酶研究进展 170

一、谷氨酰胺转氨酶简介 170

二、链霉菌简介 173

三、链霉菌中谷氨酰胺转氨酶的活化 177

第二节 Streptomyces hygroscopicus液体培养中谷氨酰胺转氨酶以酶原形式分泌 179

一、TGase和Pro-TGase的分离、纯化 179

二、Pro-TGase的鉴定 181

三、吸水链霉菌液体培养中TGase以酶原形式分泌 183

第三节 Streptomyces hygroscopicus液体培养中谷氨酰胺转氨酶活化过程的定位 184

一、无细胞上清液中TGase活化的沉默 184

二、细胞壁和细胞膜碎片对无细胞上清液中TGase活化的影响 185

三、无细胞上清液中TGase活化过程的唤醒 185

四、CTAB唤醒无细胞上清液中TGase活化过程的机制 186

第四节 Streptomyces hygroscopicus液体培养中谷氨酰胺转氨酶活化蛋白酶的分离纯化和种类鉴定 189

一、TGase活化蛋白酶的纯化 189

二、部分纯化的TAP酶样品中蛋白酶种类的确定 190

三、无细胞上清液中TGase活化蛋白酶种类的确定 191

四、TGase活化过程是多种蛋白酶参与的过程 192

第五节 Streptomyces hygroscopicus液体培养中谷氨酰胺转氨酶活化蛋白酶抑制因子的纯化、鉴定及其表面活性的发现 195

一、TGase活化蛋白酶抑制因子的纯化 195

二、TAPI的鉴定 195

三、TAPI是一种表面活性蛋白 198

四、TAPI调控的TGase活化过程的模型 198

五、TAPI表面活性的生理意义 199

第六节 Streptomyces hygroscopicus固体培养中谷氨酰胺转氨酶的活化过程及谷氨酰胺转氨酶抑制剂对菌体分化的抑制 200

一、吸水链霉菌固体培养中TGase的活化 200

二、CTAB促进固体培养浸出液中TGase的活化 201

三、胱胺对分化的抑制 202

四、TGase的生理功能 202

参考文献 204

第七章 软化类芽孢杆菌α-环糊精葡萄糖基转移酶在大肠杆菌中的表达及其产物特异性分析 207

第一节 α-环糊精葡萄糖基转移酶概述 207

一、α-环糊精葡萄糖基转移酶的结构、功能及反应机理 207

二、CGT酶发酵生产的研究进展 212

第二节 软化类芽孢杆菌α-CGT酶基因在大肠杆菌中的克隆与表达 218

一、表达载体pET-20b(+)/cgt和pET-22b(+)/cgt的构建 218

二、大肠杆菌表达系统的构建 220

三、重组酶在E.coli BL21(DE3)［pET-20b(+)/cgt］中的胞外生产 220

第三节 采用两阶段温度控制策略提高重组α-CGT酶的胞外产量 223

一、在不同诱导温度下重组α-CGT酶胞外分泌过程 223

二、两阶段诱导温度控制策略的确定 224

三、升温时间对重组α-CGT酶胞外生产的影响 225

四、两阶段温度控制对重组α-CGT酶在胞内外分布的影响 225

五、相关机理探讨 226

第四节 甘氨酸与钙离子协同提高重组α-CGT酶的胞外产量 231

一、甘氨酸或钙离子对α-CGT重组酶胞外分泌的影响 231

二、甘氨酸或钙离子对大肠杆菌细胞膜透性的影响 232

三、甘氨酸或钙离子对大肠杆菌细胞生长的影响 233

四、钙离子能补偿甘氨酸对大肠杆菌细胞生长的抑制作用 235

五、甘氨酸和钙离子同时添加对大肠杆菌细胞膜透性的影响 237

六、甘氨酸和钙离子协同提高重组α-CGT酶的胞外产量 237

第五节 重组α-CGT酶的分离纯化及其生化性质分析 238

一、天然和重组α-CGT酶的纯化 238

二、物理性质 239

三、最适温度和热稳定性 239

四、最适pH和pH稳定性 240

五、二价金属离子对环化活力的影响 241

六、产物特异性 242

七、动力学分析 242

第六节 亚位点-3处定点突变提高CGT酶的α-环糊精特异性 243

一、突变CGT酶的表达与纯化 243

二、定点突变影响CGT酶的不同环化活力 244

三、定点突变影响不同环糊精的生产 245

四、定点突变提高CGT酶的α-环糊精特异性 246

第七节 47位赖氨酸突变提高CGT酶的α-环糊精特异性 248

一、多重序列比对 248

二、突变CGT酶的表达与纯化 248

三、Lys47对α-环化反应非常重要 249

四、Lys47突变增加β-环化活力 250

五、Lys47突变提高CGT酶的β-环糊精特异性 251

参考文献 253

第八章 光滑球拟酵母中ATP的生理功能与作用机制 255

第一节 ATP生理功能概述 255

一、胞内微环境在微生物细胞生长和产物积累过程中的重要作用 256

二、胞内ATP供给水平的调控策略 258

三、基于ATP水平调控的发酵过程优化 260

第二节 光滑球拟酵母基因操作系统的构建 262

一、G418抗性试验 263

二、敲除框的构建 263

三、缺陷型突变株的富集与筛选 264

四、营养缺陷型突变株的验证 265

五、增强型绿色荧光蛋白的可诱导表达 266

六、质粒稳定性 266

第三节 线粒体基因敲除过程中的单细胞线粒体基因组多样性 267

一、线粒体转化 269

二、mtDNA转化子可以在YPG平板上生长 269

三、mtDNA转化子选择性丢失mtDNA(△atp6::ARG8m) 270

四、mtDNA异质性的存在 270

五、寡霉素和厌氧培养可以降低mtDNA（△atp6::ARG8m）的丢失率 271

六、厌氧培养对线粒体和mtDNA拷贝数的影响 273

七、厌氧培养降低ATP6/ARG8m比例 274

八、mtDNA（ATP6）的消除 274

九、研究意义 274

第四节 膜间腔中H＋的过量积累导致ATP6缺失菌株mtDNA不稳定 278

一、NADH氧化途径对ATP6敲除菌株中mtDNA稳定性的影响 279

二、T.glabrata及其突变株的胞内ATP浓度 280

三、T.glabrata及其突变株的胞内ROS浓度 280

四、MIMS中H＋的过量积累 281

五、ATP6缺失菌株中△ψm的不均一性 281

六、乌头酸酶的转录与定位分析 283

七、研究意义 284

第五节 ATP合成酶亚基缺失对光滑球拟酵母中心代谢途径的影响 287

一、ATP合成酶基因敲除及noxE的表达对发酵特性的影响 288

二、代谢网络分析 289

三、ATP合成酶基因敲除及noxE的表达对胞内ATP水平的影响 289

四、ATP合成酶基因敲除及noxE的表达对低pH和渗透压耐受性的影响 289

五、中心代谢关键酶基因的转录分析 291

六、中心代谢途径关键酶活性分析 291

七、研究意义 293

第六节 依赖ATP的pH平衡过程在细胞抵御酸胁迫中的作用 296

一、柠檬酸促进低pH值条件下T.glabrata的生长 296

二、胞外pH值对胞内ATP浓度的影响 297

三、柠檬酸添加促进能量代谢 298

四、提高ATP浓度促进pH梯度的维持过程 299

五、pH对糖酵解关键酶活性的影响 300

六、pH梯度与胞内ATP浓度的关系 301

七、研究意义 301

参考文献 303

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