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Ⅰ、植物基因处理方法 1

第一章 DNA的抽提方法 3

1.1 核DNA 3

1.1.1 花椰菜总DNA的抽提 3

1.1.2 从菠菜叶片抽提核DNA 6

1.2 叶绿体DNA 9

1.2.1 叶绿体的分离 9

1.2.2 叶绿体DNA的抽提 12

1.3 线粒体DNA——甜菜线粒体DNA的抽提 15

1.4 病毒DNA的抽提方法 18

1.4.1 从精制病毒粒子中抽提DNA 18

1.4.2 从感染叶片直接抽提病毒DNA的方法 23

2.1 限制酶 25

第二章 基因的检测 25

2.2 凝胶电泳 26

2.3 Southern转移杂交 27

2.3.1 Southern转移 27

2.3.2 用RNA作探针的杂交 30

2.3.3 用DNA作探针的杂交 32

第三章 使用cDNA进行克隆 35

3.1 mRNA的制备 35

3.1.1 用SDS-酚法抽提总RNA 35

3.1.2 poly（A）＋RNA的分离 37

3.2 无细胞蛋白质合成 39

3.2.1 麦胚抽提液的制备 39

3.2.2 翻译反应 41

3.3 用质粒载体建立cDNA库 43

3.3.1 单链cDNA的合成与模板mRNA的碱水解 45

3.3.2 在单链cDNA的3′OH末端加上dC的同聚物 47

3.3.3 双链cDNA的制成 48

3.3.4 对双链cDNA末端加工以插入质粒 50

3.3.5 与pstI切口3′末端加有oligodG的pBR322退火 51

3.3.6 转化 52

3.3.7 cDNA克隆的筛选 53

第四章 用Charon30进行克隆——基因组DNA的基因库 58

4.1 包装抽提液的制备 58

4.2 Charon30载体DNA及基因组DNA片段的制备 61

4.3 包装与基因库的扩增 62

第五章 特定基因的克隆 65

5.1 rRNA基因 65

5.1.1 制备含有蚕豆rDNA的EcoRI片段的DNA组分 66

5.1.2 pBR325的EcoRI酶解与碱性磷酸酯酶处理 67

5.1.3 蚕豆核DNA的EcoRI片段与载体的结合 68

5.1.4 大肠杆菌的转化 69

5.1.5 用菌落杂交法选择带有rDNA片段的重组子 70

5.2 tRNA基因 72

5.2.1 tRNA基因的克隆 72

5.2.2 tRNA基因的确定 74

5.3 重复性DNA 76

5.3.1 蚕豆核DNA用BamHI处理形成片段后，通过琼脂糖凝胶电泳分离重复序列并从胶中进行回收 76

5.3.2 蚕豆核DNA的BamHI重复序列与pBR322的结合，以及对大肠杆菌HB的转化 77

5.3.3 重组质粒中含有重复序列的验证 78

5.3.4 用2种限制酶浓缩重复DNA序列（蚕豆）FokI重复序列的例子 79

5.4 叶绿体蛋白质 81

5.4.1 转录起点和终点的决定：S1作图法 81

5.4.2 转录产物的检测：Northern杂交 84

5.5 植物ars 86

5.5.1 酵母的转化 87

5.5.2 从酵母转化子中抽提总DNA 90

5.6 大豆球蛋白A3B4中间亚基cDNA的克隆 93

第六章 RNA病毒及类病毒的克隆 99

6.1 TMV（普通株）的制备 99

6.2 TMV-RNA的制备 100

6.3 HSV的纯化 101

6.4 TMV-RNA上添加poly（A） 103

6.5 HSV上添加poly（A） 104

6.6 用冈山—Berg法克隆HSVcDNA 105

6.6.1 用载体引物合成cDNA 106

6.6.4 用DNA连接物环化 107

6.6.3 用HindⅢ切断 107

6.6.2 加上oligodC链 107

6.6.5 用缺口转移将RNA链换成DNA链 108

6.6.6 转化 108

6.7 TMVcDNA的克隆 109

6.7.1 TMVcDNA的合成 110

6.7.2 用碱性蔗糖密度梯度离心分级cDNA 111

6.7.3 cDNA上添加oligodC 111

6.7.4 用载体引物合成双链DNA 111

6.7.5 用连接酶将DNA环化和转化 112

第七章 Ti质粒的检测及制备 113

7.1 Ti质粒的检测方法 113

7.2 Ti质粒的制备方法 115

8.1 酶法 119

8.1.1 待测DNA的克隆 119

第八章 DNA碱基顺序测定法 119

8.1.2 单链DNA的制备 122

8.1.3 聚合酶反应 124

8.2 化学法（Maxam—Gilbert） 127

8.2.1 DNA5′端标记 127

8.2.2 标记DNA片段用丙烯酰胺凝胶电泳进行分离 129

8.2.3 碱基专一性反应 131

8.2.4 应用凝胶电泳确定碱基顺序 134

第九章 RNA碱基顺序测定法 137

第十章 应用DABITC方法测定蛋白质的一级结构 142

Ⅱ、细胞融合 149

第十一章 融合方法及杂种的形成 149

11.1 PEG-Ca法 149

11.2 葡聚糖法 152

11.3 烟草属杂种的育成 154

第十二章 形成变异的方法 157

12.1 铝抗性植株的育种 157

12.2 营养缺陷型变异株的形成 163

12.2.1 用诱变剂处理原生质体 163

12.2.2 营养缺陷型植株的鉴定 165

第十三章 杂种的鉴定方法 168

13.1 组分Ⅰ蛋白 168

13.1.1 烟草组分Ⅰ蛋白的结晶及其抗体的制备 168

13.1.2 组分Ⅰ蛋白样品的制备 170

13.1.3 等电聚焦电泳 172

13.1.4 组分Ⅰ蛋白的Western转移法 174

13.2 核糖体RNA基因（rDNA） 176

13.3 染色体原位杂交法 178

本书所用缩写或简称 183

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