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第1章 发酵技术(Peter F.Stanbury) 1

1　引言 1

2　微生物生长 1

3 发酵的应用 4

3.1 微生物生物量 4

3.2 微生物代谢物 4

3.3 微生物酶 7

3.4 转化过程 7

3.5 重组产品 7

4 发酵过程 7

5 产物形成的基因改良 10

5.1 诱变 10

5.2 重组 13

6 总结 15

参考文献 15

第2章 分子分析及扩增技术(Ralph Rapley) 18

1 引言 18

1.1 分子生物学研究中常用的酶 18

2 核酸的提取和分离 20

2.1 DNA 提取技术 20

2.2 RNA 提取技术 21

3 核酸电泳 21

4 DNA 片段酶切图谱 23

5 核酸印迹和杂交 24

5.1 杂交和严谨性 24

6 基因探针的制备 25

6.1 DNA 基因探针的标记 26

6.2 非放射性 DNA 标记 27

6.3 DNA 末端标记 27

6.4 DNA 的随机引物标记 28

6.5 DNA 的切口平移标记 29

7 多聚酶链式反应 29

7.1 PCR 的构成和操作过程 31

7.2 热稳定 DNA 聚合酶 33

7.3 PCR 引物的设计 33

7.4 PCR 扩增的模板 34

7.5 PCR 的灵敏度 35

7.6 PCR 技术的改良 35

7.7 PCR 的应用 36

8 其他扩增技术 37

9 DNA 的核苷酸序列分析 38

9.1 双脱氧核苷酸链终止子测序法 40

9.2 直接 PCR 测序法 40

9.3 循环测序法 40

9.4 自动荧光 DNA 测序法 41

9.5 Maxam 和 Gilbert 测序 42

10 生物信息学与因特网 43

参考文献 44

第3章 重组 DNA 技术(Ralph Rapley) 47

1 引言 47

2 基因文库的构建 47

2.1 基因组 DNA 分子的消化 47

2.2 DNA 分子的连接 48

2.3 制备基因文库应考虑的因素 50

2.4 基因组 DNA 文库 50

2.5 cDNA 文库 51

2.6 接头和衔接体 53

2.7 RNA 的浓缩方法 54

2.8 消减杂交法 54

2.9 克隆 PCR 产物 54

3 克隆载体 55

3.1 源于质粒的克隆载体 56

3.1.1 质粒筛选系统 57

3.1.2 pUC 质粒克隆载体 59

3.2 以病毒为基础的克隆载体 60

3.2.1 插入型和置换型克隆载体 61

3.3 M13和以噬菌粒为基础的克隆载体 63

3.3.1 克隆入单链噬菌体载体 64

3.4 以黏粒为基础的克隆载体 66

3.5 具有插入大片段能力的克隆载体 67

3.6 酵母人工染色体克隆载体 67

3.7 真核细胞中使用的载体 67

4 基因探针与杂交 69

4.1 克隆 DNA 探针 69

4.2 RNA 基因探针 69

5 基因文库的筛选 70

5.1 菌落与噬菌斑杂交 70

5.2 通过 PCR 筛选基因文库 71

5.3 筛选表达 cDNA 文库 71

5.4 杂交选择/扣留翻译 72

6 基因克隆的应用 73

6.1 克隆 DNA 的测序 73

6.2 体外诱变 73

6.3 寡核苷酸指导的诱变 74

6.4 基于 PCR 的诱变 74

7 外源基因的表达 75

7.1 产生融合蛋白 76

7.2 在哺乳动物细胞中表达 78

7.3 噬菌体蛋白展示 78

8 基因分析与基因表达 79

8.1 鉴定和分析 mRNA 79

8.2 逆转录 PCR 80

8.3 原位基因分析 81

8.4 转基因学和基因打靶 82

9 微型阵列与 DNA 芯片 82

10 整个基因组分析 83

10.1 基因组物理图谱 84

10.2 基因的发现和定位 85

10.3 人类基因组作图计划 87

参考文献 87

第4章 外源 DNA 在细菌中的表达(Robert J.Slater D.Ross Williams) 90

1 引言 90

2 基因表达的调控 92

2.1 原核生物 92

2.2 真核生物 94

3 真核基因在细菌中的表达 96

3.1 内含子 96

3.2 启动子 97

3.3 核糖体结合位点 98

3.4 外源 DNA 以融合蛋白的形式表达 98

3.5 天然蛋白的表达 101

4 外源基因表达的检测 103

5 最大水平地表达外源 DNA 103

5.1 大肠杆菌中表达的优化 105

6 采用其他宿主菌 107

7 展望 108

8 推荐读物 109

参考文献 109

第5章 酵母克隆和生物技术(Brendan P.G.Curran Virginia C.Bugeja) 113

1 引言 113

2 酿酒酵母的基因操作 113

2.1 将 DNA 引入酵母 113

2.2 酵母选择性标志 113

2.3 载体系统 114

3 外源蛋白生成 116

3.1 外源 DNA 的来源 116

3.2 细胞中外源 mRNA 的水平 116

3.3 蛋白的产量 117

3.4 所需产物的特征 118

4 用酵母分析基因组、基因和蛋白与蛋白的相互作用 119

4.1 YAC 技术 119

4.2 基因敲除 122

4.3 新的报告系统 125

5 未来的展望 126

参考文献 127

第6章 在哺乳动物细胞系中克隆基因(Edward J.Murray) 130

1 引言 130

2 DNA 转染方法 131

2.1 磷酸钙共沉淀 132

2.2 DEAE 葡聚糖 132

2.3 电穿孔 132

2.4 原生质体融合 133

2.5 脂染 133

2.6 Polybrene-DMSO 处理 134

2.7 显微注射 134

2.8 刮染 134

3 基因表达的要求 135

4 DNA 组分 137

4.1 载体的使用 137

4.2 质粒类载体 138

4.3 病毒类载体 138

4.4 腺病毒载体 139

4.5 逆转录病毒载体 139

4.6 痘病毒载体 140

4.7 杆状病毒载体 141

5 选择细胞系的一些设想 142

6 瞬时表达与稳定表达 143

6.1 通过宿主细胞缺陷互补筛选 143

6.2 显性选择技术 143

6.3 可扩增的选择系统 145

参考文献 145

第7章 植物生物技术(Michael G.K.Jones) 148

1 引言 148

2 应用分子生物学加快作物品种改良过程 148

2.1 作物植物的分子图谱 148

2.2 分子标记物 149

2.3 分子标记物类型 149

2.4 分子标记物的辅助选择 150

2.5 分子标记物辅助选择举例 151

2.6 分子诊断 151

2.7 DNA 指纹图谱、变异鉴定 152

2.8 DNA 微阵列 152

2.9 生物信息学 152

3 转基因技术 153

3.1 农杆菌介导的转化 153

3.2 选择标记和报告基因 153

3.3 粒子轰击法 153

4 转基因技术的应用 154

5 抗除草剂的工程作物 155

6 对病虫害的抗性工程 156

6.1 昆虫抗性工程 156

6.2 植物病毒抗性工程 157

6.3 真菌致病菌抗性 158

6.4 自然抗性基因工程 159

6.5 真菌致病菌抗性工程 161

6.6 细菌致病菌抗性工程 161

6.7 线虫致病菌抗性工程 162

7 人工雄性不育 162

8 胁迫耐受性 163

9 性状控制 163

9.1 延长贮存期 164

9.2 营养和技术性状 164

9.2.1 蛋白 164

9.2.2 植物油 164

9.2.3 淀粉性状改良 165

9.2.4 果糖 166

9.3 代谢分配调节 166

10 植物聚合物和生物可降解塑料的生产 166

11 植物生物反应器、生物药物和营养品 167

11.1 可食用植物疫苗 167

11.2 利用植物生产抗体 167

11.3 植物营养品 167

12 植物生物技术在林业中的应用 168

13 知识产权 168

14 公众接受程度 169

15 展望 170

参考文献 170

第8章 药学研究中的分子、结构和化学生物学(Tomi K.Sawyer) 174

1 引言 174

2 疾病和体内转基因模型的分子生物学 174

3 基因组蛋白质靶位与重组治疗学 176

4 结构生物学与合理化药物设计 180

5 化学生物学与分子多样性 184

6 基因治疗与 DNA/RNA 靶向治疗 187

7 药物研究的发展前景 188

8 小结 189

参考文献 189

第9章 遗传修饰食物(Rosa K.Pawsey) 196

1 引言 196

2 新食品生产与加工所需的法律依据 196

3 食用农作物 201

4 食用动物 203

5 制造类食品的发展趋势 204

6 消费者认可与市场压力 206

参考文献 208

第10章 遗传病的分子诊断(Elizabeth Green) 210

1 引言 210

2 基因突变的直接检测 211

2.1 基因缺失、倍增和插入的检测 211

2.2 扩展突变的检测 212

2.3 点突变的检测 215

2.3.1 等位基因特异的寡核苷酸杂交分析 215

2.3.2 限制性酶切位点分析 215

2.3.3 ARMS 216

2.3.4 寡核苷酸连接试验 216

2.3.5 荧光标记 DNA 测序分析 218

3 用连锁性遗传标记进行间接诊断 220

4 前景展望 220

参考文献 221

第11章 DNA 在法医学中的应用(Paul Debenham Peter D.Martin) 222

1 引言 222

2 多位点探针和单位点探针 223

2.1 MLP/SLP 方法 225

2.1.1 DNA 的提取和纯化 225

2.1.2 定量 226

2.1.3 DNA 的限制性核酸内切酶消化 226

2.1.4 电泳分离 226

2.1.5 杂交 226

2.2 结果分析 227

3 PCR 技术 228

3.1 最初以 PCR 为基础的法医系统 228

4 短串联重复序列 229

4.1 方法 229

4.1.1 DNA 的提取 229

4.1.2 DNA 的定量 230

4.1.3 DNA 的扩增 231

4.1.4 产物分离 231

5 数据库 231

6 结果解释 233

7 线粒体 DNA 234

8 Y 染色体分析 235

9 展望 235

9.1 毛细管电泳 235

9.2 DNA 芯片技术 236

参考文献 237

第12章 免疫接种和基因操作(Michael Mackett) 239

1 引言 239

2 目前的免疫接种策略 240

2.1 灭活疫苗 241

2.2 减毒活疫苗 242

2.3 活疫苗与死疫苗的相对优缺点 242

3 遗传工程在疫苗的鉴定、分析和生产过程中的作用 243

3.1 具有疫苗潜力的抗原的鉴定和克隆 243

3.1.1 DNA/寡核苷酸杂交 244

3.1.2 杂交筛选和无细胞翻译 244

3.1.3 表达克隆 244

3.1.4 基因组测序 245

3.2 疫苗抗原的分析 246

3.2.1 B 细胞表位 246

3.2.2 T 细胞表位 247

3.3 亚单位疫苗的产生 248

4 改进和研究新的减毒活疫苗 250

4.1 对现有的减毒活疫苗进行改进 250

4.1.1 新的假狂犬病毒疫苗 250

4.1.2 改善霍乱弧菌的减毒作用 251

4.1.3 增强稳定性——脊髓灰质炎病毒(Poliovirus) 252

4.2 重组活载体 252

4.2.1 重组牛痘病毒 252

4.2.2 重组卡介苗 253

4.2.3 减毒沙门菌作为活菌苗 254

4.2.4 脊髓灰质炎病毒的嵌合体 254

4.2.5 交叉接种、“活/死”疫苗 254

4.2.6 其他病毒载体 255

4.2.7 重组大肠杆菌 255

5 构建疫苗的其他方法 255

5.1 DNA 疫苗(遗传免疫) 255

5.1.1 优化反应 256

5.1.2 RNA 免疫 257

5.2 肽苗 257

5.3 抗独特型 258

5.4 增强免疫原性和改进免疫反应 259

5.4.1 佐剂、蛋白载体、运载工具 259

5.4.2 蛋白载体 259

5.4.3 黏膜免疫 260

5.4.4 细胞因子调节 260

5.4.5 抗原靶向调节 260

5.4.6 信号调节 261

6 摘要和结论 261

7 推荐的阅读材料和信息来源 262

参考文献 264

第13章 转基因(Linda J.Mullins John J.Mullins) 268

1 引言 268

2 通过显微注射制备转基因动物 268

2.1 转基因小鼠 268

2.2 转基因大鼠 270

2.3 动物的选择 270

2.4 显微注射技术在其他动物上的应用 271

2.5 动物克隆 271

3 胚胎干细胞技术、同源重组和转基因 271

4 总论 274

4.1 表达载体 274

4.2 异位表达 274

5 转基因实验的设计 275

5.1 基因表达透视 275

5.2 基因功能的减弱 275

5.3 细胞剔除 276

5.4 条件基因修饰 276

5.4.1 使用 Cre-lox 系统的可诱导基因打靶 276

5.4.2 四环素/三苯氧胺 278

6 商业应用 278

6.1 转基因动物生物制药 278

6.2 异种移植 279

6.3 毒理学应用 279

6.4 “永生”鼠 280

7 展望 280

参考文献 280

第14章 蛋白质工程(John R.Adair) 286

1 引言 286

1.1 蛋白质结构 286

2 工具 287

2.1 序列鉴定 287

2.2 结构测定与模建 287

2.3 序列修饰 288

2.3.1 定点突变方法 288

2.3.1.1 非 PCR 方法 288

2.3.1.2 PCR 方法 289

2.4 分子进化 292

2.5 从头序列设计 292

2.6 表达 293

2.7 分析 294

3 应用 294

3.1 点突变 295

3.1.1 Betaseron/Betaferon(干扰素β-1b) 295

3.1.2 Humalog(Lispro Insulin) 295

3.1.3 新疫苗佐剂 295

3.2 结构域改组(连接、交换和删除) 296

3.2.1 连接域 296

3.2.1.1 细胞靶向区域融合 296

3.2.1.2 细胞因子融合 296

3.2.1.3 稳定二聚体蛋白的融合 297

3.2.2 交换蛋白质结构域 297

3.2.2.1 鼠和人的嵌合体抗体 297

3.2.2.2 多聚乙酰合成酶 298

3.2.3 缺失结构域 299

3.3 全蛋白的重组 299

3.4 蛋白质-配体相互作用 299

3.4.1 酶修饰 299

3.4.2 激素拮抗剂 299

3.4.3 结合特异性替换 300

3.5 关于从头设计 301

4 总结与展望 301

参考文献 301

第15章 生物信息学(Peter M.Woollard) 306

1 引言 306

2 数据库 308

2.1 序列数据库 308

2.1.1 核酸序列数据库 310

2.1.2 蛋白质序列数据库 311

2.1.3 蛋白质家族和模体数据库 312

2.2 基因组数据库 312

2.3 酶数据库 313

2.4 文献数据库 314

2.4.1 Medline 314

2.4.2 BIDS Embase 314

2.4.3 BIDS ISI 314

3 序列分析 314

3.1 序列数据库搜索 314

3.1.1 关键词搜索 315

3.1.2 数据库搜索 316

3.2 两两序列比较、联配和多重序列比较、联配 317

3.2.1 两两比较 317

3.2.2 多重序列联配 318

3.2.3 改进联配 320

3.2.4 谱型(profile)搜索 320

3.3 其他的核酸序列分析 321

3.3.1 基因识别 321

3.3.2 限制性作图 321

3.3.3 单核苷酸多肽性 321

4 蛋白质结构 321

5 作图 322

5.1 引言 322

5.2 连接分析 322

5.3 物理作图 322

5.4 辐射杂交 322

5.5 引物设计 323

6 生物信息学站点和中心 323

6.1 局域生物信息学服务 323

6.2 国家的 EMBnet 节点 323

6.3 专门的站点 324

7 结论和未来的展望 324

参考文献 324

第16章 生物催化剂的固定化(Gordon F.Bickerstaff) 327

1 引言 327

2 生物催化剂 327

2.1 酶 327

2.1.1 专一性 328

2.1.2 催化活力 329

2.2 核糖酶 329

2.3 抗体酶 330

2.4 多酶复合体 331

2.4.1 丙酮酸盐脱氢酶复合物 331

2.4.2 蛋白酶体 331

2.4.3 纤维酶复合体 331

2.4.4 多酶复合体和固定化技术 332

2.5 细胞 332

2.5.1 动物细胞 333

2.5.2 植物细胞 333

2.5.3 微生物(细菌、酵母和纤维状真菌) 334

2.6 生物催化剂的选择 334

3 固定化 335

3.1 固定化载体的选择 335

3.1.1 下一代固定化载体 336

3.2 固定化过程的选择 337

3.2.1 吸附法 337

3.2.2 共价结合 338

3.2.3 包埋法 340

3.2.4 微囊法 341

3.2.5 交联法 341

4 固定化生物催化剂的性质 342

4.1 稳定性 342

4.2 催化活性 343

5 应用 344

参考文献 345

第17章 下游过程——蛋白质提取和纯化(Mike D.Scawen P.M.Hammond) 347

1 引言 347

2 细胞破碎 348

2.1 酶法破碎细胞 348

2.2 化学法破碎细胞 348

2.2.1 碱处理 348

2.2.2 表面活性剂 349

2.3 物理法破碎细胞 349

2.3.1 渗透压冲击 349

2.3.2 球磨法 349

2.3.3 固体剪切 349

2.3.4 液体剪切 349

3 初级纯化 350

3.1 细胞碎片去除 350

3.2 分批离心 350

3.3 连续流动离心 350

3.4 筐式离心机 351

3.5 膜过滤 351

4 双水相萃取 352

5 沉淀 353

5.1 硫酸铵 353

5.2 有机溶剂沉淀 353

5.3 高分子聚合物 353

5.4 热沉淀 353

6 色谱 353

6.1 放大及质量管理 354

6.2 方法选择 355

6.3 介质选择 356

6.4 凝胶过滤 357

6.5 离子交换色谱 358

6.6 亲和色谱 359

6.7 疏水色谱 361

6.8 高效液相色谱技术 361

6.9 灌注色谱 362

6.10 膨胀床吸附 363

6.11 膜色谱 363

6.12 柱填充介质的维护 364

6.13 大规模色谱设备 364

6.14 控制和自控 365

7 超滤 365

8 为纯化过程而进行的蛋白质设计 366

8.1 包涵体 366

8.2 亲和尾 367

9 未来的趋势 369

参考文献 369

第18章 单克隆抗体(Christopher J.Dean) 372

1 引言 372

2 抗体结构 372

3 用体细胞融合技术制备杂交瘤 373

3.1 技术原理 373

3.2 骨髓瘤细胞系的选择 373

3.3 制备免疫 B 细胞的宿主动物的选择 374

3.4 免疫原和免疫途径 375

3.5 融合用骨髓瘤细胞系和宿主免疫淋巴细胞的制备 376

3.6 体细胞融合法制备杂交瘤 376

3.7 杂交瘤培养上清的筛选 376

3.8 杂交瘤的克隆 377

3.9 单克隆抗体的大量生产、分离和纯化 378

3.9.1 大量生产 378

3.9.2 分离和纯化 378

4 用于研究大分子结构和功能特性的大鼠单抗制备实例 379

4.1 HIV I gp120 379

4.2 抗生长因子受体单抗 380

4.3 应用于临床的单克隆抗体 381

5 用基因重组技术生产单克隆抗体 381

5.1 免疫球蛋白可变区基因的分离及在噬菌体表面的表达 381

5.1.1 轻、重链可变区 mRNA 的分离和 cDNA 的制备 382

5.1.2 抗体 VH 和 VLcDNA 的 PCR 扩增 383

5.1.3 单链抗体基因的构建 383

5.1.4 将单链抗体基因插入噬粒载体 383

5.1.5 单链抗体在噬菌体表面的表达 383

5.1.6 噬菌体抗体库的筛选 384

5.1.7 可溶性单链抗体的制备 384

5.1.8 含可溶性单链抗体上清的筛选 384

6 单克隆抗体在生物医学研究中的应用 384

7 单克隆抗体在疾病的诊断和治疗中的应用 385

参考文献 386

第19章 生物传感器(Martin F.Chaplin) 389

1 引言 389

2 生物反应 392

3 理论 393

4 电化学方法 394

4.1 安培型的生物传感器 395

4.2 电位型生物传感器 399

4.3 电导型生物传感器 402

5 量热型生物传感器 403

6 压电传感器 405

7 光学型生物传感器 406

7.1 消隐波生物传感器 407

7.2 表面等离子体共振 408

8 细胞传感器 409

9 免疫传感器 411

10 结论 411

参考文献 411

索引 413

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