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1 酶的分离工程 1

1.1 酶分离纯化的一般原则 1

1.1.1 建立一个可靠和快速的测活方法 1

1.1.2 酶原料的选择 1

1.1.3 酶的提取 1

1.1.4 酶的提纯 2

1.1.5 酶的纯度检验 2

1.2 酶提取方法的选择 2

1.2.1 生物材料的破碎 2

1.2.2 抽提方法 4

1.3 酶纯化方法的选择 4

1.3.1 调节酶溶解度的方法 4

1.3.2 根据酶分子大小、形状不同的分离方法 6

1.3.3 根据酶分子电荷性质的方法 7

1.3.4 根据酶分子专一性结合的方法 9

1.3.5 其他分离方法 14

1.3.6 酶纯化方法的选择 15

1.4 酶纯度的评价 16

1.4.1 酶纯度的检验 16

1.4.2 酶催化活性的检验 18

1.4.3 酶活性部位滴定 18

2 酶作用动力学 19

2.1 酶的基本动力学 19

2.1.1 Michaelis-Menten方程 19

2.1.2 Briggs-Haldane修饰的Michaelis-Menten方程 20

2.1.3 米氏方程的意义 21

2.1.4 米氏方程中Km,Vmax的测定 22

2.1.5 可逆反应的Haldane关系式 25

2.2 King-Altman法推导酶动力学方程 25

2.3 酶的抑制动力学 31

2.3.1 酶的可逆抑制 31

2.3.2 酶的不可逆抑制 37

2.3.3 酶抑制剂的设计及研究进展 44

2.4.1 pH值对酶作用的影响 48

2.4 pH值和温度对酶作用的影响 48

2.4.2 温度对酶作用的影响 55

2.5 酶作用于多底物时的动力学 57

2.5.1 酶促反应按底物数分类 57

2.5.2 多底物反应动力学分类 58

2.5.3 Cleland命名和表示法 59

2.5.4 双底物反应恒态动力学 60

2.5.5 多底物反应机制的鉴别 65

2.6.1 酶反应的分析 69

2.6 稳态前动力学 69

2.6.2 流管法 70

2.6.3 弛豫时谱法 71

2.6.4 恒态前动力学 72

3 酶的作用机制 77

3.1 酶催化的化学机制 77

3.1.1 酸碱催化 78

3.1.2 共价催化 78

3.1.5 微观可逆原理 79

3.1.3 元催化 79

3.1.4 金属离子催化 79

3.2 酶催化的专一性与高效性 80

3.2.1 过渡态和活化能 80

3.2.2 酶和底物的结合作用 81

3.2.3 邻近和定向效应 81

3.2.4 底物的形变和酶的诱导契合模型 83

3.2.5 微环境的影响 84

3.3 酶的活性部位柔性的假说 84

3.3.1 酶的活性丧失和整体构象变化的关系 85

3.3.2 酶活性部位的柔性 86

3.3.3 酶活性部位柔性和整体结构刚性的实例 86

3.4 辅因子在酶促反应中的作用 87

3.4.1 金属激活酶和金属酶 87

3.4.2 辅酶 90

3.5 酶作用机制的研究方法 98

3.5.1 动力学研究 98

3.5.3 X－射线晶体衍射法 100

3.5.2 “捕捉”酶－底物复合物 100

3.5.4 质谱法 101

3.5.5 氨基酸侧链的化学修饰 101

3.5.6 定点突变 103

3.6 酶反应机制实例 107

3.6.1 丝氨酸蛋白酶 107

3.6.2 乳酸脱氢酶 119

3.6.3 酪氨酰－tRNA合成酶 123

3.6.4 超氧化物歧化酶 127

4 酶活性的调节和酶的转换 133

4.1 酶活性调节的多样性 133

4.1.1 酶浓度的调节 133

4.1.2 激素调节 133

4.1.3 共价修饰调节 133

4.1.4 限制性蛋白水解作用 133

4.1.8 金属离子和其他小分子化合物的调节 134

4.1.7 变构调节 134

4.1.6 反馈调节 134

4.1.5 抑制剂和激活剂的调节 134

4.1.9 蛋白质剪接 135

4.2 通过配体诱导酶构象改变的活性调节 135

4.2.1 配体和蛋白质的结合 135

4.2.2 变构酶 143

4.3 通过酶共价结构改变的活性调节 149

4.3.1 共价结构不可逆改变的活性调节 149

4.3.2 共价结构可逆改变的活性调节 151

4.4 代谢途径中酶活性的调节 154

4.4.1 磷酸果糖激酶 154

4.4.2 磷酸化酶 156

4.5 酶的转换 157

4.5.1 酶合成的调节 158

4.5.2 酶降解的调节 158

5 同工酶 160

5.1 同工酶的结构基础 160

5.1.1 同工酶的一级结构的差异 160

5.1.2 构象变化造成同工酶的差异 161

5.1.3 同工酶亚基的杂交 163

5.2 同工酶与基因 164

5.2.1 单基因决定的同工酶 164

5.2.2 多基因决定的同工酶 164

5.2.3 复等位基因决定的同工酶 164

5.2.4 修饰同工酶 164

5.3 同工酶的分离、纯化及鉴定 165

5.3.1 几种常用分离和测定同工酶的方法 165

5.3.2 同工酶类型的鉴别 166

5.4 同工酶的应用 168

5.4.1 同工酶与临床诊断 168

5.4.2 遗传与进化中的同工酶 169

5.4.3 代谢调节中的同工酶 171

5.4.4 癌瘤状态下同工酶谱改变的生物学意义 175

5.4.5 发育与分化中的同工酶 176

6 核酶 178

6.1 核酶的发现和类别 178

6.2.1 Ⅰ型内含子的自我剪接 179

6.2 核酶的催化类型 179

6.2.2 异体催化剪切型 182

6.2.3 自体催化剪切型 183

6.3 核酶的应用前景 184

6.3.1 作为RNA限制性内切酶 184

6.3.2 作为抗病因子 184

6.3.3 生命起源的探索 184

7.1 酶作用的过渡态及过渡态类似物 186

7.2 抗体酶的催化反应 186

7 抗体酶 186

7.2.1 酰基转移反应 187

7.2.2 重排反应 187

7.2.3 氧化还原反应 187

7.2.4 金属螯合反应 188

7.2.5 磷酸酯水解反应 188

7.2.6 磺酸酯闭环反应 189

7.2.7 光诱导反应 189

7.3.3 诱导法 190

7.3.2 引入法 190

7.3 抗体酶的制备方法 190

7.3.1 拷贝法 190

7.4 发展前景 192

8 模拟酶 194

8.1 环糊精模拟酶 194

8.1.1 α－胰凝乳蛋白酶的模拟 196

8.1.2 核糖核酸酶的模拟 197

8.1.3 转氨酶的模拟 198

8.2 冠醚化合物的模拟酶 199

8.2.1 水解酶的模拟 199

8.2.2 肽合成酶的模拟 200

8.3 超氧化物歧化酶（SOD）的模拟 200

8.3.1 CuZn-SOD活性中心的模拟 201

8.3.2 超氧化物歧化酶的功能模拟 201

8.3.3 模拟Mn-SOD 201

9.1 引言 203

9.2 氧化一氧化碳的酶 203

9 气体酶学 203

9.2.1 羧基养细菌的CO脱氢酶 204

9.2.2 硫酸盐还原细菌中的CO脱氢酶 205

9.2.3 光养厌氧菌的CO脱氢酶 205

9.2.4 甲烷养细菌的甲烷单加氧酶 205

9.2.5 关于氧化CO的酶的总结 205

9.3 甲烷单加氧酶的作用 206

9.3.1 甲烷单加氧酶的性质 206

9.3.2 可溶性MMO复合体中的电子转移 207

9.3.3 甲烷单加氧酶的底物专一性 208

9.4 固氮酶的作用 208

9.4.1 概述 208

9.4.2 固氮酶的酶学简介 208

10 非水介质中的酶催化反应 210

10.1 非水介质酶催化反应及其特征 210

10.2 微水有机溶剂体系 211

10.2.1 水的作用及其调控 211

10.2.2 有机溶剂的影响与反应介质工程 216

10.2.3 酶的选择与催化剂工程 221

10.3 “pH记忆”与“分子印迹”技术 225

10.4 反向胶团的酶学研究 225

10.4. 1反向胶团的形成与酶的包覆 226

10.4.2 反向胶团包覆酶的催化特性 227

10.4.3 反向胶团酶学的应用 227

10.5 水－有机溶剂两相体系 229

10.5.1 两相体系的特点与构成 229

10.5.2 固定化催化剂在两相体系中的应用 229

10.5.3 两相体系的应用 230

10.6 非水介质酶催化反应在有机合成中的应用 231

10.6.1 脂肪酶及其对映体选择性催化原理 231

10.6.2 对映体选择性拆分 232

10.6.3 消旋酸的酶促拆分 234

10.6.4 消旋醇的拆分 234

10.6.6 酶促大环内酯的合成 235

10.6.5 消旋胺的拆分 235

10.6.7 区域选择性催化 236

10.6.8 溶剂及催化剂纯度对选择性的影响 236

11 酶的分子工程 238

11.1 设计酶化学修饰的注意点 238

11.1.1 对酶性质的了解 238

11.2.1 几种重要的修饰反应 239

11.2 酶分子侧链基团的化学修饰 239

11.1.3 对酶反应条件的选择 239

11.1.2 对修饰剂的要求 239

11.2.2 特定氨基酸残基侧链基团的化学修饰 241

11.2.3 化学修饰反应的条件控制 246

11.3 有机大分子对酶的化学修饰 247

11.3.1 聚乙二醇 248

11.3.2 右旋糖酐及右旋糖酐硫酸酯 250

11.3.3 糖肽 251

11.3.4 具有生物活性的大分子物质 252

11.3.5 蛋白质类及其他 253

11.4.1 热稳定性 255

11.4 修饰酶的性质及特点 255

11.4.2 抗原性 256

11.4.3 体内半衰期 257

11.4.4 最适pH 257

11.4.5 酶学性质的变化 258

11.4.6 对组织的分布能力变化 258

12 酶化学修饰的定量处理及不可逆抑制动力学 260

12.1 Ray-Koshland方法 260

12.2 邹承鲁作图法 262

12.3 酶化学修饰的动力学机制 269

12.3.1 不可逆反应 269

12.3.2 可逆反应 270

12.3.3 形成中间体复合物 270

12.4 利用失活动力学确定酶－配位体解离常数 271

12.4.1 由不可逆失活动力学机制确定酶－配体的解离常数 271

12.4.3 酶化学修饰反应的pH效应 273

12.4.2 存在中间体复合物的失活动力学反应的酶－配体的解离常数的确定 273

12.5 酶活性修饰过程中底物反应动力学 274

12.5.1 单底物酶反应，非配合型抑制剂 274

12.5.2 单底物酶反应，配合型抑制剂 276

12.5.3 双底物酶反应，非配合型抑制剂 277

12.5.4 双底物酶反应，配合型抑制剂 281

12.5.5 可逆抑制剂和不可逆抑制剂的底物竞争性概念的统一 285

12.6 不可逆抑制动力学在其他方面的应用 285

12.6.1 酶脱配体的动力学 286

12.6.2 酶在变性剂中失活的动力学 287

13 氧自由基与酶 290

13.1 氧自由基在生物体内的作用 290

13.1.1 自由基的生物学意义 290

13.1.2 生命过程中某些重要的自由基反应 290

13.2 生物体内自由基的产生和清除 292

13.2.1 生物体内自由基的产生 292

13.2.2 自由基的清除 297

13.3.1 超氧化物歧化酶 302

13.3 生物体内一些重要的抗氧酶 302

13.3.2 过氧化氢酶 312

13.3.3 谷胱甘肽过氧化物酶 315

13.3.4 谷胱甘肽转硫酶 321

13.3.5 其他过氧化物酶 322

13.3.6 过氧化氢酶与谷胱甘肽过氧化物酶的协同作用 324

14.1 参与细胞跨膜信号转导的受体 326

14.1.1 G蛋白偶联受体 326

14 参与细胞跨膜信号转导的酶 326

14.1.2 酪氨酸蛋白激酶相关受体 327

14.1.3 其他有酶活力的受体 327

14.1.4 尚未确定有酶活力的受体——离子通道受体 327

14.2 G蛋白家族 327

14.2.1 异三聚体G蛋白 327

14.2.2 小分子G蛋白 329

14.3 核苷酸环化酶 331

14.3.1 腺苷酸环化酶 331

14.4.1 磷脂酶类 333

14.3.2 鸟苷酸环化酶 333

14.4 产生脂类信号分子的酶 333

14.4.2 磷脂酰肌醇激酶 337

14.5 蛋白激酶 338

14.5.1 环核苷酸依赖性蛋白激酶 339

14.5.2 脂类依赖性蛋白激酶 340

14.5.3 钙调蛋白依赖性蛋白激酶 344

14.5.4 丝裂源激活蛋白激酶信号流中的蛋白激酶家族 347

14.5.5 酪氨酸蛋白激酶 349

14.6.1 环腺苷酸介导的跨膜信号转导 351

14.6 重要的细胞跨膜信号转导通路 351

14.6.2 磷脂酶C介导的跨膜信号转导 353

14.6.3 受体酪氨酸蛋白激酶介导的跨膜信号网络 357

14.6.4 异三聚体G蛋白介导的跨膜信号网络 359

14.6.5 受体通过非受体型酪氨酸蛋白激酶的跨膜信号转导 360

14.6.6 鞘磷脂酶－神经酰胺介导的跨膜信号转导 360

14.6.7 受体丝氨酸蛋白激酶介导的跨膜信号转导 362

14.6.8 细胞信号转导通路间的对话 362

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