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第一章 概述 1

第一节 组织工程学的基本概念 1

第二节 组织工程的内容及发展 2

一、发展 2

二、组织工程和再生医学 2

三、组织工程支架材料 3

四、弹性模量在促进骨再生的生物材料中的作用 3

五、支架材料对拮抗细胞引发的收缩的作用 4

六、添加基因的支架材料 4

第三节 组织工程展望 5

一、组织工程，再生医学和基因治疗所用材料的未来 5

二、力学负载对细胞功能的影响 5

三、组织工程的未来 5

参考文献 5

第二章 组织工程细胞培养基本知识 7

第一节 细胞培养实验室的建立 7

一、细胞培养室的功能划分 7

二、细胞培养的设备和器具 8

第二节 培养用液 11

一、水、缓冲溶液与平衡盐溶液 11

二、培养液 13

三、体外培养的其他常用液 16

第三节 原代培养和传代培养 18

一、原代培养的过程 18

二、传代培养的过程 22

第四节 细胞培养的基本方法和技术 23

一、二倍体细胞培养法 23

二、中空纤维细胞培养技术 24

三、微载体细胞培养法 24

四、微囊培养技术 27

第五节 培养物的冻存与复苏 27

一、原理 27

二、冷冻保存方法 28

三、冻存细胞的复苏 29

第六节 培养物的污染 30

一、微生物污染的判断 30

二、污染的预防 31

三、污染的排除 32

参考文献 32

第三章 常用组织细胞的培养技术 34

第一节 上皮组织的细胞培养 34

一、上皮组织细胞体外生长的特殊条件 34

二、表皮细胞的体外培养 35

三、血管内皮细胞的体外培养 37

四、食管黏膜上皮细胞的培养 39

五、肠黏膜上皮细胞的培养 40

第二节 结缔组织的体外培养 41

一、成纤维细胞的体外培养 41

二、前脂肪细胞的培养 43

三、骨髓间充质干细胞的体外培养 44

第三节 骨与软骨组织的体外培养 45

一、成骨细胞的培养 46

二、破骨细胞的培养 49

三、软骨细胞的培养 51

四、滑膜细胞的培养 53

第四节 肌肉组织的体外培养 55

一、骨骼肌细胞培养所需主要材料 55

二、啮齿类动物骨骼肌细胞原代培养方法 56

三、从啮齿类动物肌肉中获取高纯度肌源性细胞的方法 59

第五节 神经组织的体外培养 60

一、大鼠小脑皮质神经元的体外培养 60

二、大鼠星形胶质细胞的体外培养 62

三、大鼠雪旺细胞的体外培养 64

参考文献 66

第四章 应力场与细胞生长 69

第一节 概述 69

第二节 微重力细胞培养 69

第三节 可变应力场细胞培养 70

一、应力场细胞培养方法 70

二、应力场对细胞结构和功能的影响 71

三、应力场三维细胞培养实例 73

第四节 旋转培养系统 77

一、旋转培养系统及其特点 77

二、旋转培养系统的分类 78

三、旋转培养系统的应用范围 80

四、旋转培养系统应用的局限性 81

参考文献 81

第五章 细胞培养与生长因子 82

第一节 概述 82

一、骨形成蛋白 83

二、表皮生长因子 83

三、成纤维细胞生长因子 83

四、转化生长因子-β 83

第二节 IGF-Ⅰ与细胞生长 84

一、概述 84

二、IGF-Ⅰ及IGF-IR的生物学功能 85

第三节 bFGF与细胞生长 86

一、基本概况 86

二、bFGF的生物活性 87

第四节 BMP与细胞生长 89

一、概述 89

二、BMP成熟蛋白分子结构的研究 90

三、BMP的理化特性 91

四、BMP与细胞生长相关的生物活性 91

五、BMP的靶细胞 93

第五节 TGF-β与细胞生长 94

一、概述 94

二、TGF-β膜受体 94

三、TGF-β的生物学作用 95

第六节 VEGF与细胞生长 97

一、概述 97

二、VEGF表达及生成的调节相关因素 97

三、VEGF的生物学特性 99

四、VEGF对机体的作用 99

第七节 EGF与细胞生长 100

一、EGF的分离纯化 101

二、EGF受体与基因 101

三、EGF的生物学作用 101

第八节 生长因子促细胞生长的调控 104

一、磷脂酶C的磷酸化及活化 105

二、PKC的活化 105

三、对其他活性蛋白的磷酸化和活化 105

参考文献 106

第六章 细胞的基因改造 107

第一节 概述 107

第二节 细胞寿命与细胞周期调控 108

一、CDKs、cyclin、CKIs三家族 108

二、细胞周期的其他调控因素 109

三、正常细胞的限制点与G/S转换 111

四、S期和M期的检控点 112

第三节 细胞增殖寿命的延长 112

一、导入病毒癌基因延长细胞寿命 112

二、端粒酶与细胞寿命 114

三、恶性表型的控制 116

第四节 种子细胞的功能基因转染 117

一、皮肤细胞功能的改造 117

二、肌细胞基因改造 117

三、神经细胞功能基因转染 118

第五节 细胞基因改造常用技术 118

一、基因转移系统 118

二、端粒酶活性测定 121

参考文献 121

第七章 干细胞培养技术 123

第一节 几种研究热点干细胞概述 123

第二节 人骨髓间充质干细胞的分离培养 126

一、人骨髓间充质干细胞的分离培养 126

二、人骨髓间充质干细胞鉴定 127

第三节 小鼠肌肉干细胞的分离培养及分化技术 130

一、成肌细胞的分离培养 130

二、肌肉源间充质干细胞的分离培养及鉴定 131

第四节 神经干细胞的分离培养及鉴定 132

一、小鼠室管膜细胞源神经干细胞的分离培养 132

二、分离、培养星形胶质细胞来源的神经干细胞 132

三、神经干细胞的鉴定 133

第五节 造血干细胞的分离纯化、体外培养及多向分化 133

一、造血干细胞的识别及分离原则 133

二、免疫磁珠阳性分选法 134

三、造血干/祖细胞的体外测定 134

第六节 小鼠胚胎干细胞的体外培养及分化实验技术 138

一、小鼠ES细胞的培养 138

二、ES细胞多向分化的基本原则 139

三、ES细胞向造血细胞的分化诱导技术 140

四、ES培养及分化实验过程中常见的问题及处理方法 141

五、ES细胞向其他细胞分化常用的诱导剂 141

参考文献 142

第八章 细胞形态和功能的检测技术 145

第一节 概述 145

第二节 细胞形态学观察 145

一、活细胞培养 146

二、固定染色观察法 147

三、组织化学和细胞化学 149

四、免疫细胞化学 149

五、电子显微镜观察 150

六、细胞骨架观察 151

第三节 细胞生长能力检测技术 152

一、细胞生长曲线的测定 153

二、细胞克隆形成率测定 153

三、流式细胞仪检测细胞周期和DNA合成 154

第四节 细胞遗传性状检测技术 155

一、细胞染色体核型分析及显带分析 155

二、细胞成瘤性分析 157

第五节 细胞功能检测 157

一、成纤维细胞 158

二、成肌细胞 158

三、肌腱细胞 160

四、成骨细胞 160

五、破骨细胞 164

六、雪旺细胞 168

七、软骨细胞 169

八、前脂肪细胞 170

九、肝细胞 170

十、口腔黏膜角化细胞 171

参考文献 172

第九章 细胞包埋技术 174

第一节 概述 174

一、细胞包埋的意义 174

二、影响细胞微包囊的主要因素 174

第二节 用于细胞包埋的生物材料 175

一、对用于细胞包埋材料的要求 175

二、天然高分子材料 176

三、合成高分子材料 179

第三节 细胞包埋技术 181

一、细胞包埋的原理 181

二、液滴的形成方法 182

三、凝胶化和微包囊外膜的形成方法 183

第四节 细胞包埋相关技术及其应用 185

一、人工胰脏 186

二、人工肝脏 186

参考文献 187

第十章 生长因子的控制释放技术 191

第一节 生长因子 191

一、概述 191

二、生长因子的特性 191

三、生长因子的控制释放 191

四、生长因子控制释放体系 191

第二节 微包囊的载体材料 192

一、载体材料的分类 192

二、脂质体 192

三、合成高分子材料 192

第三节 生长因子的控制释放技术 193

一、微包囊控制释放体系 193

二、水凝胶控制释放体系 195

第四节 生长因子控制释放体系存在的问题 195

一、生长因子的凝聚和失活 195

二、生长因子的爆发释放和多阶段释放 196

第五节 一些生长因子控制释放的研究 197

一、碱性成纤维细胞生长因子 197

二、骨形态发生蛋白 197

三、转化生长因子 198

四、类胰岛素生长因子 199

参考文献 199

第十一章 细胞示踪技术 203

第一节 概述 203

第二节 细胞的同位素标记和放射自显影技术 203

第三节 细胞的荧光标记 205

一、雪旺细胞荧光染色标记 205

二、荧光标记细胞的检测和鉴定 206

第四节 报告基因转染细胞用于细胞标记 207

一、报告基因的选择 207

二、报告基因转染 207

三、筛选稳定转化细胞 209

四、报告基因表达产物的分析 209

第五节 其他用于组织工程研究的标记技术 210

一、BrdU(5-溴脱氧尿嘧啶)标记法 210

二、新骨生成的四环素标记 210

三、短串联重复位点检测种子细胞在体内的存活 211

四、短串联重复基因的PCR-凝胶电泳检测 212

参考文献 213

第十二章 天然细胞外基质制备技术 215

第一节 概述 215

第二节 胶原 215

一、胶原的结构和分类 215

二、胶原的分离和提纯 216

三、胶原的交联 218

第三节 脱细胞真皮 218

一、概述 218

二、脱细胞真皮的制备 219

第四节 骨基质明胶 220

第五节 去细胞、去基质骨 221

一、煅烧骨的制备 221

二、生物衍生骨的制备 222

第六节 去细胞、去抗原周围神经 222

一、概述 222

二、去细胞、去抗原神经的制作方法 223

第七节 去细胞、去抗原肌腱 224

一、概述 224

二、鼠尾肌腱的处理 224

三、生物衍生人肌腱支架材料的制备 224

第八节 小肠黏膜下基质 225

一、概述 225

二、小肠黏膜下基质的制备 225

第九节 其他脱细胞脱抗原基质的制备 227

一、脱细胞猪主动脉瓣的制备 227

二、脱细胞猪主动脉血管基质的制备 227

参考文献 228

第十三章 人工合成的细胞外基质 230

第一节 概述 230

一、人工细胞外基质 230

二、人工细胞外基质的设计 230

第二节 羟基磷灰石 232

一、HA的制备 233

二、HA特性 234

第三节 生物活性玻璃和玻璃陶瓷 235

一、生物活性玻璃和玻璃陶瓷 235

二、生物活性玻璃(陶瓷)与骨整合 235

三、BGC表面似骨磷灰石形成 235

四、BGC的力学性能 236

五、生物活性玻璃 237

六、生物活性玻璃陶瓷A-W 238

第四节 HA/β-TCP 238

一、磷酸三钙(TCP) 238

二、双相磷酸钙(BCP) 238

第五节 PLA、PGA与PLGA 239

一、PLA 239

二、PGA 241

三、PLGA 241

参考文献 242

第十四章 复合型人工细胞外基质 243

第一节 概述 243

第二节 PLA与HA复合 243

一、固液相分离技术 243

二、压制成型 244

三、锻塑成型 245

四、仿生过程 246

第三节 HA与胶原复合 246

一、共沉淀HA原位复合胶原 246

二、胶原基材生物矿化 247

第四节 HA与生长因子复合 247

一、BMP载体——控制释放和细胞分化因子 247

二、BMP/微晶HA 248

参考文献 248

第十五章 细胞与细胞外基质的联合培养技术 250

第一节 概述 250

第二节 种子细胞与支架材料的接种 250

一、细胞接种前的准备 250

二、细胞与支架的接种技术 251

第三节 影响细胞与支架材料复合的因素 253

一、支架材料的影响 253

二、细胞的影响 254

三、培养方法的影响 255

四、应力应变的影响 256

参考文献 256

第十六章 动物体内植入技术 258

第一节 概述 258

一、实验动物分类 258

二、实验动物的选择 259

三、动物实验设计的注意事项 262

第二节 组织工程化组织的体内植入技术 263

一、组织工程骨体内植入 263

二、组织工程软骨体内植入技术 264

三、组织工程肌腱植入技术 266

四、组织工程周围神经体内植入技术 267

五、组织工程皮肤体内植入技术 267

第三节 体内植入物的标记及取材 268

一、移植物的标记 268

二、移植物的取材 269

参考文献 270

第十七章 组织工程化组织动物体内植入的检测技术 271

第一节 概述 271

第二节 大体观察 272

一、对动物个体的观察 272

二、对局部组织及植入物的观察 272

第三节 组织学检查 273

一、软组织的组织学检查 273

二、硬组织材料的组织学检查 276

第四节 免疫组织化学检查 278

一、免疫组织化学检查的一般原则 278

二、Ⅰ型胶原染色 278

三、Ⅱ型胶原染色 279

第五节 原位杂交检查 280

一、原位杂交检查在组织工程研究中的应用 280

二、原位杂交检查的方法 280

第六节 超显微结构观察 282

一、扫描电子显微镜 282

二、透射电子显微镜 282

第七节 血循环观察 283

一、动态观察 283

二、静态观察 283

第八节 影像学检查 283

一、超声波检查 284

二、X线检查 284

三、CT检查和MRI检查 284

第九节 电生理检查 285

一、电生理检查仪的基本构成部分 285

二、电生理检查在组织工程研究中的应用 286

三、动物电生理检查的一般原则和操作步骤 286

四、运动神经传导检查方法 287

五、感觉神经传导检查方法 288

六、混合神经传导检查方法 289

第十节 免疫学检查和生化检查 290

一、免疫学检查 290

二、生化分析 291

参考文献 300

第十八章 组织工程的分子生物学技术 301

第一节 组织工程的分子克隆技术 301

一、分子克隆的概念及其在组织工程中的意义 301

二、分子克隆的技术要点 301

三、基因克隆实例介绍 304

第二节 基因转染技术 311

一、常用基因转染技术的分类 311

二、常用基因转染技术的操作规程 313

第三节 功能基因的表达与调控 316

一、表达载体的组成元件 317

二、常用的哺乳动物细胞表达载体及其特点 317

第十九章 组织工程化组织的临床应用技术 322

第一节 概述 322

一、组织工程化组织形成的主要技术路线 322

二、临床应用的基本条件 322

第二节 组织工程骨的临床应用 325

一、种子细胞的选择 325

二、支架材料的选择 326

三、细胞与支架材料的联合培养 326

四、手术方法 326

五、结果 327

六、手术适应证及禁忌证 327

第三节 组织工程肌腱的临床应用 328

一、种子细胞的选择 328

二、支架材料的选择 329

三、细胞与支架材料的联合培养 330

四、手术方法 330

五、结果 331

六、手术适应证及禁忌证 331

第四节 其他组织工程化组织的临床应用 331

一、组织工程软骨的临床应用 331

二、组织工程皮肤的临床应用 332

三、其他组织工程化组织的临床应用 332

第五节 组织工程临床应用的检测技术 332

一、一般检查 333

二、化验检查 333

三、免疫学检查 333

四、影像学检测 333

五、活体组织检查 334

六、基因检测 334

七、功能检测 335

参考文献 335

第二十章 组织工程展望 337

第一节 概述 337

一、种子细胞的研究进展 337

二、支架材料的研究进展 338

三、组织构建研究进展 339

四、组织工程的临床应用 340

第二节 组织工程尚需研究的科学问题 341

一、种子细胞的进一步研究 341

二、支架材料的研究 343

三、细胞与支架材料的相互作用 343

四、动物体内植入试验 343

五、临床验证研究 343

六、检测及评价 344

七、产业化研究 344

第三节 展望 344

一、巨大的病人需求 344

二、政府的重视 345

三、企业介入 345

参考文献 345

中西文名词对照 347

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